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我国凉粉草资源丰富、价格低廉，有广阔的产品开发利用前景，凉粉草在日常饮食中被用作黑凉粉的原料，也被用于生产制作凉茶、龟苓膏等食品，凉粉草资源的生产加工附加值较低。凉粉草精油（M.EO）作为凉粉草中具有活性的组分之一，其受到的关注较少，现有的一些研究报道集中在其组分的种类及含量分析，鲜有关于抗菌活性的报道。植物精油为高附加值的产品，因此研究M.EO的生物活性将为凉粉草资源的高值化开发与利用提供新的思路和理论依据。
华南理工大学食品科学与工程学院的罗伟斌、曹扬建、赵振刚*等通过水蒸气蒸馏法提取M.EO，并通过气相色谱-质谱（GC-MS）联用仪分析其组成；选择在食品行业广泛应用的材料分别作为表面活性剂和助表面活性剂，在凉粉草精油微乳液（M.EO-ME）构建前使用伪三元相图来筛选合适的助表面活性剂、表面活性剂、表面活性剂与助表面活性剂质量比（Km）和混合表面活性剂与油相的质量比（Smix）；通过黏度、电导率、亚甲基蓝扩散情况、粒径、多分散指数（PDI）来表征微乳液的构型变化和理化性质；最后采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、氧自由基吸收能力（ORAC）、过氧自由基清除能力（PSC）法以及人恶性黑色素瘤细胞A375细胞模型来比较M.EO和M.EO-ME的抗氧化、抗肿瘤细胞增殖活性，以期为凉粉草资源的高值化开发与利用提供理论依据，为凉粉草精油的商业化应用提供新思路。
1、M.EO的化学组分
从M.EO分离出42种组分，根据峰面积归一化法计算各组分相对含量，其中相对含量高于1%的组分有17种，占总峰面积的91.58%。由表1可知，M.EO中相对含量较高的组分有香树烯（25.53%）、β-石竹烯（19.31%）、异石竹烯（11.30%）、甲位葎草烯（8.30%）、佛术烯（7.62%），这些组分主要为烯萜类化合物及其氧化物。
2、M.EO-ME的构建和优化
助表面活性剂对微乳液形成的影响
从图1可知，3种助表面活性剂形成的微乳区域相对面积由大到小依次为无水乙醇＞1,2-丙二醇＞甘油，随着助表面活性剂羟基数量的增加，微乳区域相对面积减小。这可能是由于醇类分子体积的增加不利于水-油界面膜的弯曲，引起微乳结构向液晶相转变。醇类分子在油相中的溶解性提高会抑制水相或油相的极性调节作用，从而更容易产生液晶相。
表面活性剂对微乳液形成的影响
由图2可知，不同表面活性剂的微乳区域相对面积由大到小依次为吐温60＞吐温80＞吐温40＞吐温20。这一结果与表面活性剂的结构有关，不同的吐温系列表面活性剂，它们每一分子都有20 个环氧乙烷亚基，但疏水链的长度、脂肪酸类型和酯化程度不同，吐温20和吐温40的疏水链长分别为12和16，而吐温60和吐温80的疏水链长为18，但酯化程度有所区别。除了以上的因素外，表面活性剂与助表面活性剂、油相的亲和性也会影响微乳液的形成能力和稳定性。因此，选择吐温60作为表面活性剂进行后续研究。
Km对微乳液形成的影响
如图3所示，微乳区域相对面积随着Km的增大而增大，Km为3∶1时，微乳区域相对面积达到最大值45.49%。当Km为1∶2时微乳区域相对面积较小，可能是由于混合表面活性剂的乙醇含量较高，大部分的乙醇溶解于水相中，而没有吸附在水-油界面膜上，这降低了界面膜的弹性，使微乳液稳定性下降。而Km为2∶1和3∶1时，体系中的表面活性剂含量较高，它们被吸附到界面膜上，提升了界面膜的强度和稳定性，因此微乳区域相对面积较大。Km为2∶1时微乳区域相对面积略小于3∶1时，且两者都具有Smix＝9∶1和Smix＝8∶2两条水无限稀释线，为了稳定增溶更多的M.EO，因此，选择Km＝2∶1和Smix＝8∶2进行后续研究。
3、M.EO-ME的构型表征
图4表示微乳液随水分质量分数变化下的电导率与黏度变化趋势。电导率的变化可以揭示微乳液体系相转变过程。在水分质量分数0～30%范围内，电导率随着水分质量分数的增加而缓慢增加，非离子型表面活性剂与油相将少量的水包裹、隔离，小水滴间很少发生碰撞与接触，因此电导率增加缓慢，微乳液为油包水（W/O）型。在水分质量分数30%～60%范围内，电导率随着水分质量分数的增加而快速增加，此时小水滴开始相互碰撞与接触，导电通道逐步完善，因此电导率快速增加，微乳液为双连续（B.C型）构型。
图5展示了水溶性染料亚甲基蓝在微乳液中的扩散情况。与电导率、黏度的变化规律类似，当水分质量分数小于30%的范围内，此时为W/O型微乳液，油相占据体系的主导，且密度比水小，因此亚甲基蓝染料集中在底部；当水分质量分数达到30%～50%时，微乳液构型向B.C型转变，随着水分质量分数的增加，亚甲基蓝染液在体系中的扩散范围逐渐增大；当水分质量分数达到60%及以上，B.C型微乳液转变为O/W型，水相开始占据体系的主导，亚甲基蓝染料扩散得更充分、均匀。综合以上结果以及微乳液构建的目的，选择水分质量分数为70%的O/W型微乳液进行后续的研究。
4、M.EO-ME的理化性质和稀释稳定性
M.EO-ME的粒径分布结果如图6所示，M.EO-ME在稀释前后均为单峰分布，对比原始状态（即稀释前），稀释后的微乳液粒径分布更集中。由表2可知，M.EO-ME电导率为260 μS/cm，具有较强的导电性；黏度较低，为8.19 mPags，说明体系具有良好的流动性。稀释前的平均粒径为（22.92±0.10）nm，PDI为0.36±0.00，说明体系粒径较小，粒径分布较为均一。稀释后平均粒径与PDI都出现显著下降（P＜0.05）。
5、M.EO及其微乳液的抗氧化活性评价
DPPH自由基清除能力
如图7A所示，M.EO和M.EO-ME的DPPH自由基清除率与精油含量呈剂量依赖效应，两者的曲线类似，EC 50 分别为（1.43±0.07）、（1.27±0.11）mg/mL（以精油计）。由图7B可知，M.EO经微乳化处理后DPPH值略有提高，微乳化前后的DPPH值分别为（29.37±5.71）μmol/g和（33.08±7.50）μmol/g，无显著差异（P＞0.05）。由此说明，微乳液的构建并没有影响M.EO的抗氧化活性。
氧自由基清除能力和过氧自由基清除能力
如图8所示，M.EO和M.EO-ME的ORAC分别为（0.52±0.02）、（1.33±0.12）μmol/mg，PSC分别为（2.95±0.22）、（24.84±1.81）μmol/g。综合ORAC和PSC结果可知，微乳液ORAC和PSC分别显著提升为M.EO的2.6 倍和8.4 倍（P＜0.05），推测微乳液通过改善M.EO的水溶性，从而提高其在水溶性体系中的抗氧化活性。
6、M.EO和M.EO-ME对A375细胞的细胞毒性和抗增殖活性
M.EO和M.EO-ME对A375细胞毒性和抗增殖活性如图9所示。对比对照组，M.EO和M.EO-ME的抗增殖活性呈剂量依赖关系。M.EO质量浓度为60～360 μg/mL时，细胞毒性最大为（7.26±1.46）%，低于10%，表现出极低的毒性，细胞增殖抑制率（100%－细胞增殖率）最大达（60.05±2.50）%。M.EO-ME质量浓度为10～70 μg/mL时，细胞毒性最大为（9.43±3.65）%，细胞增殖抑制率最大达（59.51±1.15）%，同样在极小的毒性下表现出较好的抗增殖活性。
结 论
本实验使用水蒸气蒸馏法提取得到M.EO，其主要组分经GC-MS分析确定为香树烯（25.53%）、β-石竹烯（19.31%）、异石竹烯（11.30%）、甲位葎草烯（8.30%）、佛术烯（7.62%）。以M.EO为油相，运用伪三元相图筛选确定吐温60为表面活性剂，无水乙醇为助表面活性剂，Km＝2∶1，Smix＝8∶2的微乳液。微乳液经100、200 倍水稀释仍保持稳定。最后，对比研究M.EO和M.EO-ME的DPPH自由基清除能力、ORAC、PSC和抗肿瘤细胞增殖活性，发现微乳液在M.EO具有较好的抗氧化和抗肿瘤细胞增殖活性的基础上，显著提高了其ORAC、PSC以及抗肿瘤细胞增殖活性（P＜0.05）。本研究为凉粉草资源的高值化开发与利用提供了新的思路，为M.EO在保健食品、药品和日化产品的开发利用提供了一定的理论参考。关于M.EO的抗增殖机理需要进一步的研究。
本文《凉粉草精油微乳液抗氧化和抗A375细胞增殖活性》来源于《食品科学》2022年43卷9期1-9页，作者：罗伟斌，曹扬建，吴尔文，赵振刚。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210417-239。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅
图片来源于文章原文及摄图网。
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